Kryo-Elektronenmikroskopie: Eine futuristische Technologie für die Krebsforschung

Jedes Jahr werden bei etwa 20 Millionen Menschen Krebserkrankungen diagnostiziert und fast 10 Millionen sterben daran. Während Proteinfehlfunktionen die Hauptursache für bösartige Erkrankungen sind, die die zelluläre Homöostase stören, ist der Zusammenhang zwischen genetischen Anomalien und Krebs in der Krebsforschung allgemein bekannt. Bislang konzentrierte sich die Krebsprävention auf die Verringerung der negativen Folgen von Genveränderungen. In der Chemoprävention gibt es jedoch einen zunehmenden Trend, die Proteine ​​zu verändern, die von diesen beschädigten Genen kodiert werden. Beispielsweise hilft das BRCA1-Protein bei der Reparatur von DNA-Schäden, was bei der Tumorunterdrückung eine Rolle spielt. Bei weniger funktionsfähigen BRCA1-Personen entwickelt sich eine erhöhte genetische Instabilität, was das Risiko einer Krebsentstehung erhöht.

Einzelpartikelanalyse und Kryo-Tomographie sind zwei Beispiele für die Methodenfamilie der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), die zur Erzeugung hochauflösender Strukturdaten für biologische Systeme verwendet wird. Bei der Kryo-EM werden Probenlösungen schnell eingefroren, um die natürliche Struktur der Proben zu erhalten und die Bildung von kristallinem Eis zu verhindern. Dadurch entsteht eine Suspension einzelner Proteine, die in verschiedenen zufälligen Winkeln im Eis angeordnet sind, was bei der Einzelpartikelanalyse beobachtet wird. Die Proteine ​​werden dann mit einem Kryo-Transmissions-Elektronenmikroskop (Kryo-TEM) visualisiert, wodurch Hunderte von 2D-Projektionen der Probe erstellt werden. Durch die Kombination dieser Projektionen kann dann ein hochauflösendes 3D-Modell des Proteins erstellt werden. Eine atomare Auflösung ist denkbar und wird mit modernen Elektronendetektoren und Analysewerkzeugen immer verfügbarer.

Durch die Kombination von Kryo-EM und 3D-Rekonstruktion konnten in den letzten Jahren eine Reihe bedeutender Fortschritte in der Strukturbiologie erzielt werden. Fortschritte bei Hardware und Software waren ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung der Kryo-EM. Das Bildaufzeichnungsgerät und das Elektronenmikroskop sind Beispiele für die Hardware; 3D-Rekonstruktionstechniken und Bilddatenverarbeitung sind Beispiele für die Software.

Data Bridge Market Research analysiert die Wachstumsrate des globalen Marktes für Kryo-Elektronenmikroskopie im Prognosezeitraum 2022–2029. Die erwartete CAGR des globalen Marktes für Kryo-Elektronenmikroskopie liegt im genannten Prognosezeitraum bei etwa 8,67 %. Der Markt wurde im Jahr 2021 auf 725,43 Millionen USD geschätzt und soll bis 2029 auf 1.410,82 Millionen USD wachsen. Der globale Markt für Kryo-Elektronenmikroskopie ist nach Typ, Produkttyp, Komponente und Anwendung segmentiert.

Weitere Informationen zur Studie finden Sie unter: https://www.databridgemarketresearch.com/de/reports/global-cryo-electron-microscopy-market

Das Konzept in Kürze

Die Verwendung der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur Untersuchung der molekularen Architektur von Proteinanordnungen, Viren und Organismen wird immer üblicher. Diese Seite konzentriert sich auf verschiedene Aspekte der Kryo-EM, einschließlich ihrer Vor- und Nachteile, Anwendungen, Unterschiede zu EM-Techniken und neuere Studien unter Verwendung der Kryo-EM-Technologie. Der Begriff „Kryo-EM“ bezieht sich auf eine Art elektromagnetischer Bildgebung (EM), bei der strahlungsempfindliche Proben unter kryogenen Bedingungen mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) abgebildet werden. Der Begriff „Kryo-EM“ wird häufig verwendet, um sich auf verschiedene experimentelle Techniken zu beziehen, darunter Kryo-Elektronentomographie, Elektronenkristallographie und Einzelpartikel-Kryo-EM.

Jede Kryo-EM-Technik kann unabhängig oder als Teil hybrider Ansätze genutzt werden, die Kryo-EM-Daten mit ergänzenden Daten aus Röntgenkristallographie- und Kernspinresonanzspektroskopie-Ansätzen (NMR) kombinieren. Für die Bildgebung biologischer Proben, darunter Bakterien, tiefgefrorene Zellen und ganze Gewebeschnitte, werden Kryo-EMs immer häufiger verfügbar und deutlich einfacher zu handhaben.

Forscher nutzen derzeit Kryo-EM zur Unterstützung ihrer Arbeit an Krebserkrankungen und entwickeln damit die Disziplin der „strukturellen Onkologie“ weiter, deren Ziel darin besteht, die Strukturbiologie zur Bekämpfung von Krebs einzusetzen. Die analytischen Fähigkeiten der hochauflösenden Kryo-EM werden die Art und Weise, wie Wissenschaftler Onkologie erforschen, verändern, indem sie gezielte Beobachtung, Analyse und schließlich Behandlung ermöglichen.

EM und Kryo-EM

Bei herkömmlichen EM-Verfahren werden zur Bilderzeugung Proben gefärbt, dehydriert und chemisch fixiert. Bei der EM werden biologische Proben durch die Wechselwirkung von organischer Materie und Elektronen schwer geschädigt. Da bei der Kryo-EM dagegen keine zusätzlichen Bildgebungsverfahren erforderlich sind, bleibt der ursprüngliche hydratisierte Zustand der Proben erhalten. Die Elektronenbestrahlung bricht die chemischen Bindungen der Proben auf, wodurch freie Radikale entstehen, die die Proben weiter schädigen. Niedrige Elektronendosen erzeugen verrauschte Bilder, obwohl sie zur Konservierung der Proben beitragen können, indem sie Strahlenschäden verringern.

Kryo-EM kann dieses Problem effizient lösen, da es gefrorene Proben verwendet, die zur Bildgebung bei Temperaturen von flüssigem Helium oder flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, wodurch die schädlichen Auswirkungen der Elektronenbestrahlung auf die Proben verringert werden. Die biologischen Proben werden bei Temperaturen von flüssigem Helium oder flüssigem Stickstoff fotografiert, nachdem sie schnell in einer glasähnlichen Eisschicht vitrifiziert wurden. Strahlenschäden sind bei Stickstofftemperaturen deutlich geringer, sodass eine höhere Elektronendosis eingesetzt werden kann, um Bilder mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen. Durch die Kryo-EM-Technik ist es möglich, dreidimensionale (3D) Rekonstruktionen von Proben auf nahezu molekularer Ebene in flüssigem Stickstoff und Helium zu erhalten. Aber wie funktioniert Kryo-EM?

• Einfrieren- Ein Gitter wird mit der Probe beschichtet, die anschließend in flüssigem Ethan gefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wird. Es muss schnell genug gefrieren, um zu verhindern, dass vorhandenes Wasser Eiskristalle bildet. Eisgitter verursachen wahrscheinlich strukturelle Schäden am Material, da sie den Elektronenstrahl absorbieren und das Bild verdecken. Wasser erstarrt als amorpher Feststoff (Glaseis) und kristallisiert nicht, wenn die Probe schnell genug gefroren wird.

• Aufzeichnung- Basierend auf den Wechselwirkungen der Substanz mit einem Elektronenstrahl werden Bilder von vielen Kopien des Moleküls (oder anderen Materials, wie etwa Viren), die in zufälliger Orientierung in verglastem Eis schweben, aufgenommen. Bilder mit neueren „direkten Elektronendetektoren“ sind von höherer Qualität als die mit früheren Digitalkameras aufgenommenen.

• Datenverarbeitung- Die Struktur der Probe wird ermittelt, indem die vielen molekularen Perspektiven zu einem 3D-Modell zusammengefügt werden. Manchmal ergibt der Durchschnitt von Zehntausenden oder sogar Hunderttausenden von Partikelbildern das endgültige Bild oder die Dichtekarte. Hunderttausende von Bildern pro Sekunde werden aufgenommen, um die Bewegung der Partikel zu verfolgen und Auflösungsverluste zu vermeiden.

Frühe Kryo-EM-Anwendungen waren durch die Notwendigkeit eingeschränkt, Elektronenstrahlen mit geringer Leistung zu verwenden, um die Probe zu konservieren, was zu Bildern mit niedriger Auflösung führte. Dank der Fortschritte in der Technologie der direkten Elektronendetektoren können jetzt hochauflösende Bilder mit weniger Elektronen erstellt werden. Der direkte Elektronendetektor ist eine Kamera, die durch eine verbesserte Fähigkeit zur Elektronenerkennung schnell Fotos eines einzelnen Moleküls mit Dutzenden von Bildern pro Sekunde aufnehmen kann. Die Entwicklung besserer Bildverarbeitungstechniken hat die Revolution in der Kryo-EM ebenfalls erleichtert. Solche Algorithmen werden benötigt, um die Bildausrichtung zu bestimmen und die Bilder auszurichten, damit Methoden möglich sind, mit denen aus zweidimensionalen Bildern ein dreidimensionales Bild erstellt werden kann. Durch technologische Fortschritte konnte die maximale Größe der Proben, die eingefroren werden können, gesenkt werden, sodass einzelne Proteine ​​nach der Bildgebung analysiert werden können.

Vorteile der Kryo-EM-Technologie

Kernspinresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie waren frühere Methoden der Strukturbiologie. Da große Probenmengen erforderlich sind, waren diese Ansätze nur begrenzt anwendbar. Um Röntgenkristallographie durchführen zu können, müssen die Proben kristallisiert werden, ein anspruchsvolles Verfahren, bei dem die Umgebung in eine unphysiologische umgewandelt wird.

Kryo-EM eignet sich gut für die Abbildung von Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung, da keine großen Probenmengen oder Kristallisation erforderlich sind. Der Ansatz ermöglicht auch die Analyse der Probe in ihrer natürlichen physiologischen Umgebung, da sie nicht chemisch fixiert oder gefärbt wird. Darüber hinaus können Strukturen in einer Vielzahl von Konformationen schockgefroren werden, um Rückschlüsse auf biologische Systeme zu ermöglichen, ohne dass Kristalle die Probe in einer statischen Position einfrieren müssen.

Die Tatsache, dass das Molekül, um das es geht, nicht kristallisiert werden muss, ist ein wesentlicher Vorteil der Kryo-EM gegenüber der Röntgenkristallographie. Manche Proteine ​​oder wichtige Makromoleküle können einfach nicht kristallisiert werden; bei anderen wird die Struktur durch die Kristallisation irreversibel verändert. Anders als bei der Röntgenkristallographie, die nur eine einzige Struktur bestimmen kann, können Proteine ​​in allen ihren Konformationen dargestellt werden.

Anders als bei der herkömmlichen Elektronenmikroskopie werden Kryo-EM-Proben weder dehydriert noch gefärbt, sodass ihre Struktur nahe an der wahren Form der hydratisierten Struktur in ihrer natürlichen Umgebung bleibt und durch die Färbung keine falschen Formen entstehen. Das Einfrieren von Proben verringert die Strahlenschäden, die durch Elektronenbestrahlung entstehen können. Gefrorene Proben werden außerdem weniger wahrscheinlich durch die Niederdruck-/Vakuumbedingungen des Elektronenmikroskops beschädigt.

Nachteile der Kryo-EM-Technologie

Bilder weisen aufgrund fehlender Flecken und damit fehlendem Kontrast häufig ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis auf, was hochentwickelte Erkennungshardware und Bildverarbeitung erforderlich macht.

Die Probenpräparation kann schwierig sein, da Eisdicke und Partikelverteilung optimiert werden müssen. Proteine ​​können manchmal bevorzugte Orientierungen einnehmen, was eine 3D-Rekonstruktion unmöglich macht.

Die modernsten Kryo-EM-Geräte sind noch immer unerschwinglich teuer. Die Schaffung zentraler Einrichtungen könnte dazu beitragen, den Zugang zu Kryo-EM-Geräten zu verbessern. Kryo-EM hingegen ist für die Abbildung sehr kleiner Proteine ​​ungeeignet und benötigt viel Zeit, um Probenbilder zu erzeugen. Darüber hinaus erfordert die Technik eine sehr hohe Probenhomogenität, was die Erstellung hochauflösender Bilder flexibler Proteine ​​erschwert. Darüber hinaus ist die derzeitige Auflösung von Kryo-EM für die pharmazeutische Forschung und Entwicklung unzureichend, da die mit dieser Technik erhaltenen Bilder in einigen Fällen ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen.

Aktuelle Anwendungen der Kryo-EM-Technologie

Mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) werden bei kryogenen Temperaturen eingefrorene Proben mithilfe von Elektronen untersucht. In den letzten fünf Jahren hat sich diese Methode zur Standardmethode für die Untersuchung der Struktur biologischer Proben entwickelt und erreicht dabei manchmal eine nahezu atomare Auflösung.

Laut einem Artikel in Nature aus dem letzten Jahr haben Kryo-Elektronenmikroskope „in den vergangenen drei Jahren das Feld der Strukturbiologie erschüttert. Sie haben exquisite Details von proteinbildenden Ribosomen, zitternden Membranproteinen und anderen wichtigen Zellmolekülen enthüllt, Entdeckungen, die in führenden Zeitschriften in rasantem Tempo veröffentlicht werden“.

Die Popularität der Kryo-EM ist inzwischen soweit gestiegen, dass nur noch bestimmte Proben wie Viren und Ribosomen gelegentlich mithilfe der Röntgenkristallographie abgebildet werden. Die Kryo-EM-Bildgebung ermöglicht nun die Abbildung struktureller Veränderungen im p97-Protein in atomarer Auflösung. Da die Struktur und Wechselwirkungen dieses Proteins für die Aktivität von Krebszellen entscheidend sind, ist es ein wichtiges Ziel für die Entwicklung von Krebsmedikamenten.

Die Art der p97-Inhibitor-Bindung und Kontaktstellen wurden mithilfe der Bildgebungsfunktionen der Kryo-EM beobachtet. In dieser Studie wurden Auflösungen von 2,3 ngström erreicht, wobei die Einheit ngström 0,1 Nanometer entspricht. Mit den aktuellen Fortschritten in der Detektortechnologie und Probenvorbereitung kann die Kryo-EM möglicherweise die Auflösung noch weiter verbessern.

Data Bridge Market Research analysiert, dass der Markt für Krebsdiagnostik bis zum Jahr 2029 voraussichtlich einen Wert von 28,21 Milliarden USD erreichen wird, was einer durchschnittlichen jährlichen Wachstumsrate (CAGR) von 7,29 % während des Prognosezeitraums entspricht. Der Anstieg der Krebsfälle bietet dem Markt Wachstumschancen. Steigende technologische Fortschritte sind der entscheidende Faktor für das Marktwachstum, aber auch zunehmende Initiativen von Regierungen und globalen Gesundheitsorganisationen zur Verbreitung des Bewusstseins für Krebs, ein steigendes Wachstum bei der Zahl privater Diagnosezentren, zunehmende öffentlich-private Partnerschaften zur Verbesserung der Infrastruktur von Zentren für diagnostische Bildgebung, zunehmende Unterstützung der FDA für die Entwicklung von Biomarkern und die zunehmende Einführung neuer Durchflusszytometrie-Reagenzien für die Diagnostik und Arzneimittelforschung sind die Hauptfaktoren, die den Markt für Krebsdiagnostik antreiben.

Weitere Informationen zur Studie finden Sie unter: https://www.databridgemarketresearch.com/de/reports/global-cancer-diagnostics-market