Cada año, alrededor de 20 millones de personas reciben un nuevo diagnóstico de cáncer y casi 10 millones de personas fallecen. Si bien el mal funcionamiento de las proteínas es la causa principal de las neoplasias malignas que alteran la homeostasis celular, la relación entre las anomalías genéticas y el cáncer está bien reconocida en el campo de la investigación del cáncer. Hasta ahora, la prevención del cáncer se ha centrado en reducir las consecuencias negativas de las alteraciones genéticas. Sin embargo, existe una tendencia creciente en la quimioprevención a alterar las proteínas codificadas por estos genes dañados. Por ejemplo, la proteína BRCA1 ayuda a reparar el daño del ADN, lo que desempeña un papel en la supresión de tumores. Los individuos BRCA1 menos funcionales desarrollan una mayor inestabilidad genética, lo que aumenta el riesgo de inducción de cáncer.
El análisis de partículas individuales y la criotomografía son dos ejemplos de la familia de métodos de criomicroscopía electrónica (crio-EM) utilizados para generar datos estructurales de alta resolución para sistemas biológicos. En crio-EM, las soluciones de muestra se congelan rápidamente para preservar la estructura natural de las muestras y evitar que se forme hielo cristalino. Esto provoca una suspensión de proteínas individuales orientadas en varios ángulos aleatorios dentro del hielo, que es lo que se observa en el análisis de partículas individuales. Luego, las proteínas se visualizan utilizando un microscopio electrónico de criotransmisión (crio-TEM), creando cientos de proyecciones 2D de la muestra. La combinación de estas proyecciones puede crear un modelo 3D de alta resolución de la proteína. La resolución atómica es concebible y cada vez está más disponible con los detectores de electrones y las herramientas analíticas contemporáneas.
Al combinar crio-EM y reconstrucción 3D, en los últimos años se han logrado una serie de avances significativos en biología estructural. Los avances de hardware y software han sido un factor importante en el desarrollo de crio-EM. El dispositivo de grabación de imágenes y el microscopio electrónico son ejemplos de hardware; Las técnicas de reconstrucción 3D y el procesamiento de datos de imágenes son ejemplos del software.
Data Bridge Market Research analiza una tasa de crecimiento en el mercado global de microscopía crioelectrónica en el período de pronóstico 2022-2029. La CAGR esperada del mercado mundial de microscopía crioelectrónica tiende a rondar el 8,67% en el período de pronóstico mencionado. El mercado estaba valorado en 725,43 millones de dólares en 2021 y crecería hasta 1410,82 millones de dólares en 2029. El mercado mundial de microscopía crioelectrónica está segmentado según el tipo, el tipo de producto, el componente y la aplicación.
Para saber más sobre el estudio, visite: https://www.databridgemarketresearch.com/es/reports/global-cryo-electron-microscopy-market
El concepto en resumen
Cada vez es más común utilizar la microscopía crioelectrónica (crio-EM) para examinar la arquitectura molecular de conjuntos de proteínas, virus y organismos. Esta página se centra en varios aspectos de la crio-EM, incluidos sus beneficios y desventajas, sus aplicaciones, en qué se diferencia de las técnicas EM y estudios recientes que utilizan la tecnología crio-EM. El término "crio-EM" se refiere a un tipo de imágenes electromagnéticas (EM) en las que se obtienen imágenes de muestras sensibles a la radiación utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM) en entornos criogénicos. El término "crio-EM" se utiliza con frecuencia para referirse a varias técnicas experimentales, incluida la criotomografía electrónica, la cristalografía electrónica y la crio-EM de una sola partícula.
Cada técnica crio-EM se puede utilizar de forma independiente o como parte de enfoques híbridos que combinan datos crio-EM con datos complementarios de enfoques de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y cristalografía de rayos X. Para obtener imágenes de muestras biológicas, incluidas bacterias, células congeladas por inmersión y secciones de tejido completo, los crio-EM están cada vez más disponibles y son considerablemente más sencillos de operar.
Actualmente, los investigadores están utilizando Cryo-EM para ayudar en su trabajo sobre el cáncer, avanzando en la disciplina de "oncología estructural", cuyo objetivo es emplear la biología estructural para combatir el cáncer. Las capacidades analíticas de los EM crio de alta resolución están preparadas para transformar la forma en que los científicos estudian la oncología al permitir la observación, el análisis y, en última instancia, el tratamiento enfocados.
EM y crio-EM
En los procedimientos EM tradicionales se utilizan tinción, deshidratación y fijación química de muestras para producir la imagen. En EM, la interacción de la materia orgánica y los electrones daña gravemente a los especímenes biológicos. Por el contrario, dado que la crio-EM no requiere técnicas de imagen adicionales, conserva el estado hidratado original de las muestras. La irradiación de electrones rompe los enlaces químicos de las muestras, lo que da como resultado la producción de radicales libres que dañan aún más las muestras. Las dosis bajas de electrones producen imágenes ruidosas aunque pueden ayudar a conservar especímenes al reducir el daño por radiación.
Cryo-EM puede resolver este problema de manera eficiente ya que utiliza muestras congeladas que se mantienen a temperaturas de helio líquido o nitrógeno líquido para obtener imágenes, lo que disminuye los efectos dañinos de la irradiación de electrones en las muestras. Las muestras biológicas se fotografían a temperaturas de helio líquido o nitrógeno líquido después de ser vitrificadas rápidamente en una capa de hielo que se asemeja al vidrio. El daño por radiación disminuye mucho a la temperatura del nitrógeno, lo que permite el empleo de una dosis de electrones mayor para producir imágenes con una buena relación señal-ruido. Mediante la técnica crio-EM, es posible obtener reconstrucciones tridimensionales (3D) de muestras a un nivel casi molecular en nitrógeno líquido y helio. Pero, ¿cómo funciona la crio-EM?
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Congelación- Se recubre una rejilla con la muestra, que luego se congela en etano líquido y se mantiene en nitrógeno líquido. Debe congelarse lo suficientemente rápido como para evitar que el agua presente forme cristales de hielo. Es probable que las redes de hielo causen daños estructurales al material, absorbiendo el haz de electrones y oscureciendo la imagen. El agua se solidifica como un sólido amorfo (hielo vítreo) y no cristaliza si la muestra se congela lo suficientemente rápido.
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Grabación- A partir de las interacciones de la sustancia con un haz de electrones, se capturan imágenes de muchas copias de la molécula (u otro material, como virus) suspendidas en orientaciones aleatorias en hielo vitrificado. Las imágenes con "detectores de electrones directos" más recientes son de mayor calidad que las tomadas con cámaras digitales anteriores.
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Procesamiento de datos- La estructura de la muestra se determina fusionando las numerosas perspectivas moleculares en un modelo 3D. A veces, el promedio de decenas de miles o incluso cientos de miles de imágenes de partículas constituye la imagen final o mapa de densidad. Se capturan cientos de miles de fotogramas por segundo para seguir el movimiento de las partículas y evitar la pérdida de resolución.
Las primeras aplicaciones de crio-EM se vieron limitadas por la necesidad de emplear haces de electrones de baja potencia para preservar la muestra, lo que dio como resultado imágenes de baja resolución. Ahora se pueden crear imágenes de alta resolución con menos electrones gracias a los avances realizados en la tecnología de detección directa de electrones. El detector directo de electrones es una cámara que puede capturar rápidamente fotografías de una sola molécula a decenas de fotogramas por segundo al tener una capacidad mejorada para detectar electrones. La creación de mejores técnicas de procesamiento de imágenes también ha facilitado la revolución en crio-EM. Estos algoritmos son necesarios para determinar la orientación de la imagen y alinear las imágenes con el fin de utilizar métodos que reconstruyan una imagen tridimensional a partir de imágenes bidimensionales. La mejora tecnológica ha reducido el tamaño límite de las muestras que se pueden congelar, lo que permite analizar proteínas individuales después de obtener imágenes.
Ventajas de la tecnología Cryo-EM
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X fueron métodos anteriores de biología estructural. Debido al requisito de tamaños de muestra elevados, estos enfoques sólo han tenido una aplicabilidad limitada. Para realizar cristalografía de rayos X, las muestras deben cristalizarse, un procedimiento desafiante que altera el entorno a uno que no es fisiológico.
Cryo-EM es muy adecuado para obtener imágenes de estructuras con una resolución casi atómica porque no requiere grandes cantidades de muestra ni cristalización. El enfoque también permite analizar la muestra en su entorno fisiológico natural porque no la fija ni la tiñe químicamente. Además, las estructuras se pueden congelar instantáneamente en una variedad de conformaciones para permitir la inferencia de sistemas biológicos sin la restricción de que los cristales congelen la muestra en una posición estática.
El hecho de que la molécula de interés no tenga que cristalizarse es una ventaja significativa de la crio-EM sobre la cristalografía de rayos X. Algunas proteínas o macromoléculas importantes simplemente no pueden cristalizarse; otros tienen sus estructuras alteradas irreversiblemente como resultado de la cristalización. A diferencia de la cristalografía de rayos X, que sólo puede determinar una única estructura, las proteínas se pueden ver en todas sus conformaciones.
Las muestras crio-EM, a diferencia de la microscopía electrónica convencional, no están deshidratadas ni teñidas, por lo que su estructura permanece cercana a la forma verdadera de la estructura hidratada en su entorno nativo, sin formas falsas creadas por la tinción. La congelación de muestras reduce la cantidad de daño por radiación que puede ocurrir como resultado de la irradiación de electrones. También es menos probable que las muestras congeladas resulten dañadas por las condiciones de baja presión/vacío del microscopio electrónico.
Desventajas de la tecnología Cryo-EM
Las imágenes suelen tener una relación señal-ruido muy baja debido a la falta de coloración y, por tanto, a la falta de contraste, lo que requiere hardware de detección y procesamiento de imágenes muy avanzados.
La preparación de muestras puede resultar difícil, ya que es necesario optimizar el espesor del hielo y la distribución de las partículas. En ocasiones, las proteínas pueden adoptar orientaciones preferidas, lo que hace imposible la reconstrucción 3D.
El equipo crio-EM más avanzado sigue siendo prohibitivamente caro. La creación de instalaciones centralizadas puede ayudar a aumentar el acceso a equipos crio-EM. Cryo-EM, por otro lado, es ineficaz para obtener imágenes de proteínas muy pequeñas y lleva mucho tiempo generar imágenes de muestra. Además, la técnica requiere una homogeneidad de muestra muy alta, lo que complica la obtención de imágenes de alta resolución de proteínas flexibles. Además, la resolución actual de la crio-EM es insuficiente para la I+D farmacéutica porque las imágenes obtenidas mediante esta técnica tienen una relación señal-ruido baja en algunos casos.
Aplicaciones recientes de la tecnología Cryo-EM
La microscopía crioelectrónica, o crio-EM, estudia muestras congeladas a temperaturas criogénicas utilizando electrones. Se ha convertido en la técnica de referencia para estudiar la disposición estructural de muestras biológicas en los últimos cinco años, logrando en ocasiones una resolución casi atómica.
Según un artículo publicado en Nature el año pasado, los microscopios crioelectrónicos están "enviando temblores a través del campo de la biología estructural en los últimos tres años, han revelado detalles exquisitos de los ribosomas productores de proteínas, proteínas de membrana temblorosas y otras moléculas celulares clave, descubrimientos que las principales revistas publican a un ritmo acelerado".
La crio-EM ha ganado popularidad hasta el punto de que ocasionalmente solo se obtienen imágenes de muestras específicas, como virus y ribosomas, mediante cristalografía de rayos X. Las imágenes crio-EM ahora han proporcionado imágenes con resolución atómica de los cambios estructurales en la proteína p97. Debido a que la estructura y las interacciones de esta proteína son fundamentales para la actividad de las células cancerosas, es un objetivo importante para el desarrollo de fármacos contra el cáncer.
El tipo de sitios de unión y contacto del inhibidor de p97 se han observado utilizando las capacidades de imágenes de Cryo-advanced EM. En este estudio se lograron resoluciones de 2,3 ngström, con la unidad ngström igual a 0,1 nanómetros. Con los avances actuales en la tecnología de detectores y la preparación de muestras, la crio-EM puede mejorar potencialmente una mayor resolución.
Data Bridge Market Research analiza que se espera que el mercado de diagnóstico del cáncer alcance un valor de 28,21 mil millones de dólares para el año 2029, con una tasa compuesta anual del 7,29% durante el período de pronóstico. El aumento de los casos de cáncer brinda oportunidades de crecimiento al mercado. Los crecientes avances tecnológicos son el factor vital que intensifica el crecimiento del mercado, aumentando también las iniciativas emprendidas por los gobiernos y las organizaciones de salud globales para crear conciencia sobre el cáncer, aumentando el número de centros de diagnóstico privados, aumentando las asociaciones público-privadas para mejorar la infraestructura de diagnóstico por imágenes. Los centros, el creciente apoyo de la FDA para el desarrollo de biomarcadores y el creciente lanzamiento de nuevos reactivos de citometría de flujo para diagnóstico y descubrimiento de fármacos son los principales factores, entre otros, que impulsan el mercado de diagnóstico del cáncer.
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